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3002965587
 
Letzte Aktualisierung:
03.06.2016

Konventionelle Zellkultur

Zur Virusanzucht aus menschlichen Körpermaterialien werden je nach vermutetem Virustyp verschiedene Zelllinien eingesetzt (Tabelle 1). Eine mögliche Virusvermehrung kann man bei zytopathogenen Viren aufgrund der zellverändernden Auswirkung (CPE: zytopathogener Effekt) im Lichtmikroskop nachweisen. Da der CPE häufig nicht virusspezifisch ist, erfolgt eine weitere Identifikation (oder auch Typisierung) durch den Immunfluoreszenztest (IFT) mit monoklonalen Antikörpern (MAK).(Abbildung 1).

 

 

Tabelle 1. Viren, zum Anzucht geeignete Zellkulturen und Probenmaterialen.

Virus  
Zellkultur 
Probenmaterial, z.B. 
Adenovirus 
Graham 293, CaCo-2, HEL, Hep-2 
Rachenabstrich, Augenabstrich, Urin, Stuhl, Fruchtwasser 
CMV 
HEL 
Urin, Fruchtwasser 
Enteroviren (non Polio) 
CaCo-2, RD, HEL, Hep-2 
Stuhl, Liquor, Rachenabstrich, Fruchtwasser, Bläscheninhalt 
Herpesviren 
HEL 
Genitalabstrich, Fruchtwasser, Bläscheninhalt 
Influenza 
MDCK 
Tiefer Nasen/Rachenabstrich 
Parainfluenza 
MDCK, LLCMK2 
Tiefer Nasen/Rachenabstrich 
Poliovirus 
20B 
Stuhl 
Röteln 
Vero 
Urin, Rachenabstrich, Fruchtwasser, Abortmaterial 
RSV* 
Hep-2 
Tiefer Nasen/Rachenabstrich 
VZV* 
HEL 
Bläscheninhalt 

*RSV und VZV (Fetale VZV Infektion im ersten Trimenon) lassen sich nicht bzw. nur schlecht - insbesondere bei längerem Transport - aus klinischen Materialien anzüchten. Daher werden in unserem Labor in erster Linie Nukleinsäure-Amplifikationstechniken zum RSV bzw. VZV-Nachweis eingesetzt.

Schnellkultur (Schnellanzucht)

Da der Virusnachweis in konventionellen Zellkulturen meist mehrere Tage bis Wochen in Anspruch nimmt, erfolgt der Virusnachweis heute in der Routine meist mit Schnellkultur-Verfahren.

Das Testprinzip der Schnellkultur: Beimpfte Zellkulturen werden nach 10-18 Stunden fixiert und  zuerst mit einem virusspezifischen monoklonalen Antikörper (MAK) und danach mit einem Enzym-Konjugat (Sekundärantikörper) inkubiert. Das im anschließenden Schritt zugefügte Substrat reagiert mit dem Enzym und infizierte Zellen werden sichtbar rot (Abbildung 2).

Enzym-Immuno-Assay (EIA)

Noch schneller funktioniert der Antigennachweis EIA (Testdauer 2 Stunden). Testprinzip (Abbildung 3): Virusspezifische monoklonale Antikörper sind an der Oberfläche der Vertiefungen der Mikroplatte gebunden. Die Stuhlsuspensionen werden in die Vertiefungen gegeben und zusammen mit einem virusspezifischen Enzym-Konjugat inkubiert. Sind Viren in einer Probe vorhanden, so werden diese zwischen der festen Phase und dem Enzym-Konjugat gebunden. Nicht gebundenes Konjugat wird durch Waschen entfernt. Anschließend wird das farblose Substrat/Chromogen hinzupipettiert. Bei positiven Proben erfolgt durch die Enzymreaktion ein Farbumschlag.

Die Methode ist nur im Fall einer ausgeprägten Virusausscheidung anwendbar. Sie ist für den Rota-, Adeno- und Astrovirusnachweis bei Gastroenteritiden gut geeignet.

 

Schnelltest (Membran-Enzymimmunoassay)

Wird zur schnellen Influenzadiagnostik eingesetzt (Testdauer 10 min).

Testprinzip: Aus menschlichen Körpermaterialien extrahierte Antigene werden unspezifisch an eine Membran gebunden. Das an der Membran immobilisierte Antigen wird nach dem Waschen der Membran nachgewiesen. Hierzu werden mononukleäre Antiörperkonjugate, die spezifisch mit den Nukleoproteinen von Influenza A bzw. B reagieren, verwendet. Nicht alle positive Proben werden durch den Test erkannt (Sensitivität bei Kindern etwa 70%, Evaluierung Labor Enders).

 

Direkter Immunfluoreszenztest

Direkter Nachweis von CMV-pp65-Antigen in peripheren Granulozyten mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern.

Der Test ermöglicht eine schnelle Diagnose der CMV-Antigenämie.

 

Tabelle 2. Virusnachweismethoden im Vergleich

Methode  
Identifiziert  
Sensitivität  
Kosten werden von den gesetzlichen Krankenkassen  
Testdauer  
Gesamte Bearbeitungszeit 
PCR 
Nukleinsäure 
98-100% 
nicht übernommen für z. B. Adenoviren, Enteroviren, Herpesviren und Parainfluenza 
3 Stunden 
1 Tag 
Konventionelle Virusisolierung 
Nur infektiöse Viruspartikel 
60-90% 
übernommen 
3-10 Tage 
3-10 Tage 
Schnellkultur 
Nur infektiöse Viruspartikel 
60-90% 
übernommen 
18 Stunden 
1-2 Tage 
Antigennachweis EIA 
Infektiöse und nicht infektiöse Viruspartikel 
60-90% 
übernommen 
2 Stunden 
1 Tag 
Schnelltest (Influenza) 
Infektiöse und nicht infektiöse Viruspartikel 
60-90% 
nicht übernommen 
10 min 
ein halber Tag 

Weitere Informationen:

Prof. Dr. med. Gisela Enders (0711/6357-120), 

Dr. med. Martin Enders  (0711/6357-117),

PD Dr. Maren Eggers  (0711/6357-130)

 

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Konventionelle Zellkultur
Tabelle 1. Viren, zum Anzucht geeignete Zellkulturen und Probenmaterialen.
Schnellkultur (Schnellanzucht)
Enzym-Immuno-Assay (EIA)
Schnelltest (Membran-Enzymimmunoassay)
Direkter Immunfluoreszenztest
Tabelle 2. Virusnachweismethoden im Vergleich

Abbildung 1. Enterovirusnachweis in Zellkultur




nicht infizierte CaCo-2-Zellen
(Bilder zum Vergrößern anklicken)




virusinduzierter CPE




IFT mit dem Anti-ECHO-4 MAK

Abbildung 2. Schnellkultur




gefärbte mit dem Anti-CMV-IE-MAK infizierte Zellen
Färbung mit doppelter Antikörperreaktion (Enzyme-Ligandenassay)

Abbildung 3. EIA-Testprinzip



Abbildung 4. Direkter Nachweis (IFT)




CMV-pp65-Antigen in einem peripheren Granulozyt